Електронномикроскопско изследване

Какво представлява електронният микроскоп?

Електронният микроскоп използва лъч от ускорени електрони като източник на осветление. Тъй като дължината на вълната на електрона може да бъде до 100 000 пъти по-къса от тази на видимите светлинни фотони, електронните микроскопи имат по-висока разделителна способност от светлинните микроскопи и могат да разкрият структурата на по-малки обекти. Сканиращият трансмисионен електронен микроскоп постига разделителна способност по-добра от 50 микрона в пръстеновиден режим на изобразяване на тъмни полета и увеличения до около 10 000 000, докато повечето светлинни микроскопи са ограничени от дифракция до разделителна способност около 200 nm и полезни увеличения под 2000x. Електронните микроскопи имат електронни оптични лещи, които са аналогични на стъклените лещи на оптичен светлинен микроскоп.

За какво се използва електронният микроскоп?

Електронните микроскопи се използват за изследване на ултраструктурата на широка гама от биологични и неорганични образци, включващи микроорганизми, клетки, големи молекули, биопсични проби, метали и кристали. Съвременните електронни микроскопи произвеждат електронни микрографии, използващи специализирани цифрови фотоапарати и камери за заснемане на изображението.

Първата електромагнитна леща е разработена през 1926 година от Ханс Буш. Според Денис Габор физикът Лео Szilárd се опитва през 1928 година да убеди Буш да изгради електронен микроскоп, за който е подал патент.

Физикът Ернст Руска и електроинженерът Max Knoll изграждат прототипния електронен микроскоп през 1931 година, с възможност за увеличение от четиристотин. Апаратът е първата демонстрация на принципите на електронната микроскопия. Две години по-късно, през 1933 години, Руска изгражда електронен микроскоп, който надхвърля разделителната способност, постижима с оптичен (лек) микроскоп.

Какво представлява електронномикроскопското изследване?

Електронната микроскопия вече е рутинен метод на клетъчната патология, който се прилага успешно в почти всички области на медицината. Ултраструктурните данни служат не само за целите на фундаменталните изследвания, но имат важно приложно, диагностично значение. При електронномикроскопско изследване главно роля играе насоченото търсене на някои специфични цитоплазмени органели, чрез които може до голяма степен да се определи тъканната принадлежност на конкретно наблюдавана клетка. Това подпомага хистогенетичната характеристика на някои неопластични процеси.

Оригиналната форма на електронния микроскоп използва електронен лъч с високо напрежение за осветяване на образеца и създаване на изображение. Електронният лъч се произвежда от електронен пистолет, обикновено снабден с катод от волфрамова спирала като електронен източник. Електронният сноп се ускорява от анод, обикновено при +100 keV (40 до 400 keV) по отношение на катода, фокусиран върху електростатични и електромагнитни лещи и предаван през пробата, която частично е прозрачна за електроните. Когато излезе от пробата, електронният лъч носи информация за структурата на образеца, която се увеличава от обективната система на лещата на микроскопа.
Пространствената вариация в тази информация („изображението“) може да се види чрез прожектиране на увеличеното електронно изображение върху флуоресцентен екран, покрит с фосфорен или сцинтилаторен материал като цинков сулфид. Алтернативно, изображението може да бъде записано фотографично чрез излагане на фотографски филм или плака директно на електронен сноп, или фосфорът с висока разделителна способност, може да бъде свързан чрез оптична система от лещи или оптичен светлинен водач към сензора на цифрова камера. Изображението, открито от цифровата камера, може да се покаже на монитор или компютър.

Разделителната способност на трансмисионния електронен микроскоп се ограничава главно от сферична аберация, но ново поколение коректори за аберация са успели да преодолеят частично сферичната аберация, за да увеличат разделителната способност. Хардуерната корекция на сферичната аберация за високочестотната трансмисия на електронната микроскопия позволява създаването на изображения с разделителна способност под 0.5 angstrom (50 пиксела) и увеличения над 50 милиона пъти.

Трансмисионните електронни микроскопи

Трансмисионните електронни микроскопи често се използват в режим на дифракция на електрони. Предимствата на електронната дифракция върху рентгенова кристалография са, че образецът не е необходимо да бъде единичен кристал или дори поликристален прах. Един основен недостатък на трансмисионния електронен микроскоп е необходимостта от изключително тънки участъци от образците, обикновено около 100 нанометра. Създаването на тези тънки слоеве за биологични и материалични проби е технически предизвикателно.
Полупроводникови тънки секции могат да бъдат направени с помощта на фокусиран йонен лъч. Биологичните проби от тъкан са химически фиксирани, дехидратирани и вградени в полимерна смола, за да ги стабилизират достатъчно, за да позволят прекомерно разрязване. Секции от биологични проби, органични полимери и подобни материали може да изискват оцветяване с тежки атомни етикети, за да се постигне необходимия контраст на образа.

Сканиращият електронен микроскоп произвежда изображения чрез пробиване на образеца с фокусиран електронен лъч, който се сканира над правоъгълна област на образеца (растерно сканиране). Когато електронен лъч взаимодейства с пробата, тя губи енергия чрез различни механизми. Изгубената енергия се превръща в алтернативни форми като топлина, излъчване на нискоенергийни вторични електрони и високоенергийни електрони, светлинно излъчване или рентгеново излъчване, всички, от които осигуряват сигнали, носещи информация за свойствата на образеца повърхността, като нейната топография и състав. Изображението, показано от сканиращия електронен микроскоп, показва различния интензитет, на който и да е от тези сигнали в изображението в положение, съответстващо на позицията на лъча върху образеца, когато сигналът е бил генериран.

Обикновено резолюцията на изображението на сканиращият електронен микроскоп е по-ниска от тази на трансмисионния електронен микроскоп. Тъй като сканиращият електронен микроскоп изобразяват повърхността на дадена проба, а не нейната вътрешност, електроните не трябва да преминават през пробата. Това намалява необходимостта от обширна подготовка на пробата, за да се разреди пробата на електронна прозрачност. Сканиращият електронен микроскоп е в състояние да изобрази насипни проби, които могат да се поберат на неговата сцена и все още да се маневрират, включително и височина, по-малка от работното разстояние, което се използва, често 4 милиметра за изображения с висока разделителна способност.
Сканиращият електронен микроскоп също има голяма дълбочина на полето и така може да произведе изображения, които са добри представяния на триизмерната повърхностна форма на пробата. Друго предимство на сканиращият електронен микроскоп идва с екологични сканиращи електронни микроскопи, които могат да произвеждат изображения с добро качество и разделителна способност с хидратирани проби или в ниско, а не високо, вакуумни или под камерен газ. Това улеснява изобразяването на неопределени биологични проби, които са нестабилни във високия вакуум на конвенционалните електронни микроскопи.

В отражателния електронен микроскоп, както при трансмисионния електронен микроскоп, електронният сноп настъпва на повърхността, но вместо да се използва трансмисията или вторичните електрони, се отразява отразеният лъч от еластично разсейваните електрони. Тази техника обикновено е съчетана с рефлекторна дифракция с високи енергийни електрони и рефлекторна спектроскопия с висока енергийна загуба. Друг вариант е спинално-поляризираната нискоенергийна електронна микроскопия, която се използва за гледане микроструктурата на магнитните домейни.

Материалите, които трябва да се видят при електронномикроскопско изследване, могат да изискват обработка, за да се получи подходяща проба. Изискваната техника варира в зависимост от образеца и от необходимия анализ:

  • Химично фиксиране – за биологични проби има за цел да стабилизира мобилната макромолекулна структура на пробата чрез химично омрежване на протеини с алдехиди като формалдехид и глутаралдехид и липиди с осмиев тетраоксид.
  • Негативните оцветяващи суспензии, съдържащи наночастици или фин биологичен материал (като вируси и бактерии), се смесват за кратко с разреден разтвор на разтвор, непрозрачен с електрони, като амониев молибдат, уранил ацетат (или формат) или фосфоволфрамова киселина. Тази смес се нанася върху подходящо покрита решетка, блотира се, след което се оставя да изсъхне. Преглеждането на този препарат на трансмисионен електронен микроскоп трябва да се извърши незабавно за най-добри резултати.
  • Криофиксация – замразяване на пробата толкова бързо, в течен етан, и поддържане на течен азот или дори течни хелий температури, така че водата образува стъкловиден (не-кристален) лед. Това запазва образеца в моментна снимка на неговото състояние. Цялото поле, наречено крио-електронна микроскопия, се разклонява от тази техника. С разработването на крио- електронна микроскопия на стъкловидни секции, сега е възможно да се наблюдават проби от почти всички биологични проби, близки до тяхното естествено състояние.
  • Дехидратация – или замяна на водата с органични разтворители като етанол или ацетон, последвано от критично точково сушене или инфилтрация с втвърдяващи се смоли.
  • Вграждане на биологични проби – след дехидратация, е вградена тъкан за наблюдение в трансмисионния електронен микроскоп, така че да може да се раздели готов за гледане. За тази цел тъканта се прекарва през „преходен разтворител“ като пропилей оксид (епоксипропан) или ацетон и след това се инфилтрира с епоксидна смола. Тъканите могат да бъдат вградени директно във водноразтворима акрилова смола. След като смолата е била полимеризирана (закалена), пробата е тънка нарязана (ултратна секция) и оцветена – тогава тя е готова за гледане.
  • Вграждане – след вграждане в смола, пробата обикновено се смила и полира до огледален завършек, използвайки ултрафини абразиви. Процесът на полиране трябва да се извърши внимателно, за да се сведат до минимум драскотините и други артикули за полиране, които намаляват качеството на изображението.
  • Метално засенчване – металът (например платина) се изпарява от надлъжен електрод и се прилага върху повърхността на биологична проба под ъгъл. Повърхностната топография води до вариации в дебелината на метала, които се разглеждат като изменения в яркостта и контраста в изображението на електронен микроскоп.
  • Репликация – повърхността, засенчена с метал (например платина или смес от въглерод и платина) под ъгъл, се покрива с чист въглерод, изпарява се от въглеродни електроди под прав ъгъл спрямо повърхността. Това е последвано от отстраняване на материала на образеца (например в кисела баня, използвайки ензими или чрез механично разделяне), за да се получи повърхностна реплика, която записва ултраструктурата на повърхността и може да бъде изследвана с помощта на електронен микроскоп на трансмисията.
  • Сечение – произвежда тънки резени от проби, полупрозрачни на електрони. Те могат да бъдат нарязани на ултра микротом с диамантен нож, за да се произведат ултратънки слоеве с дебелина около 60-90 nm. Използват се и стъклени ножове за еднократна употреба, тъй като те могат да бъдат направени в лабораторията и са много по-евтини.
  • Оцветяване – използват се тежки метали като олово, уран или волфрам, за да разпръснат електронни изображения и по този начин да даде контраст между различните структури, тъй като много материали са почти „прозрачни“ за електроните. В биологията пробите могат да бъдат оцветени „en bloc“ преди вграждането им и по-късно след разрязване. Обикновено тънките участъци се оцветяват в продължение на няколко минути с воден или алкохолен разтвор на уранил ацетат, последван от воден оловен цитрат.
  • Фрагментиране чрез замразяване или замразяване – метод на подготовка, особено полезен за изследване на липидните мембрани и техните вградени протеини в „лицевата страна“. Свежите тъкани или клетъчни суспензии се замразяват бързо (криофиксация), след това се счупват чрез разрушаване или чрез използване на микротома, докато се поддържа температура на течния азот. Студената фрактурна повърхност се засенчва с изпарена платина или злато при среден ъгъл от 45 ° във вакуумен изпарител.
    Втори слой от въглерод, изпарен перпендикулярно на средната повърхностна равнина, често се извършва, за да се подобри стабилността на покритието на реплика. Образецът се връща на стайна температура и налягане, след което извънредно крехката „предварително засенчена“ метална реплика на повърхността на фрактурата се освобождава от биологичния материал, който се намира под него, чрез внимателно химично разграждане с киселини, разтвор на хипохлорит или детергент. Неподвижната реплика се измива напълно от остатъчните химикали, внимателно се улавя върху фини решетки, изсушава се и се гледа на трансмисионен електронен микроскоп.
  • Идентификация на реплика на фрагмента – методът на фрагмента на замразяване е модифициран, за да се позволи идентифицирането на компонентите на фрактурата с имуногрупиране. Вместо да се отстрани цялата подлежаща тъкан на размразената реплика като последната стъпка, преди да се гледа в микроскопа, дебелината на тъканта се свежда до минимум по време на или след процеса на счупване. Тънкият слой тъкан остава свързан с металната реплика, така че може да бъде маркиран с имуноглобулин с антитела към избраните структури. Тънкият слой на оригиналния образец на реплика със злато, прикрепен, позволява идентифицирането на структури в равнината на счупване. Съществуват и други методи, които маркират повърхността на гравирани клетки и други вариации на етикетирането на реплики.
  • Фрезоване с йонен лъч – извлича пробите, докато те не са прозрачни за електроните чрез изливане на йони (обикновено аргон) на повърхността от ъгъл и разпрашващ материал от повърхността. Подклас от това е фокусирано фрезоване с йонен сноп, където галиев йони се използват за получаване на електронна прозрачна мембрана в специфична област на пробата, например чрез устройство в микропроцесор. Фрезоването с йонен лъч може да се използва и за полиране на напречно сечение преди SEM анализ на материали, които трудно се подготвят с механично полиране.
  • Водоустойчиво покритие – ултра-атмосферово покритие от електропроводим материал, отложено или чрез изпаряване под високо налягане или чрез покритие с ниско вакуумно разпрашване на пробата. Това се прави, за да се предотврати натрупването на статични електрически полета на образеца, дължащо се на облъчването с електрони, изисквано по време на изобразяването. Покривните материали включват злато, злато / паладий, платина, волфрам, графит и други.
  • Заземяване – за да се избегне натрупването на електрическо зареждане на проводник с покритие, той обикновено е електрически свързан с държача на металната проба. Често за тази цел се използва електропроводимо лепило.

Автор: д-р Теодора Тотева-Петкова