Хистологично изследване

Хистологично изследване

Какво е хистологично изследване?

Хистологичното изследване изучава микроскопичната анатомия (микроанатомия) на клетките и тъканите на растения, животни и човек. Обикновено се извършва чрез изследване на клетките и тъканите под светлинен микроскоп или електронен микроскоп, като образеца е разрязан (нарязан на тънко напречно сечение с микротом), оцветен и монтиран на микроскопско стъкло.
Хистологичните изследвания могат да се провеждат при използване на тъканна култура, където живи човешки или животински клетки се изолират и поддържат в изкуствена среда за различни изследователски проекти. Способността за визуализиране или различно идентифициране на микроскопични структури често се усилва чрез използването на хистологични петна. Хистологията е основен инструмент на биологията и медицината.

Какво е хистопатология?

Хистопатологията, микроскопското изследване на увредени тъкани, е важен инструмент в анатомичната патология, тъй като точната диагноза на рак и други заболявания обикновено изисква хистопатологично изследване на пробите. Обучени лекари, често лицензирани патолози, са персоналът, който извършва хистопатологичен преглед и предоставя диагностична информация въз основа на техните наблюдения. Обучените лица, които подготвят хистологични образци за изследване, са хистотехници, хетероложки технолози, медицински специалисти, медицински лаборатории или биомедицински специалисти и работници в областта на биомедицинските науки. Тяхната област на обучение се нарича хистенология.

През 17-и век италианецът Марчело Малпиги изобретил един от първите микроскопи за изучаване на малки биологични образувания. Той анализира няколко части от органи на прилепи, жаби и други животни под микроскоп. Малпиги, докато изучавал структурата на белия дроб, забелязал мембранните му алвеоли и връзки между вените и артериите, които той нарекъл капиляри. Неговото откритие установява как кислородът, който дишаме, навлиза в кръвния поток и служи на тялото.

През 19 век хистологията е вече самостоятелна академична дисциплина. Френският анатом Bichat въвежда концепцията за тъкан в анатомията през 1801 година, а терминът „хистология“ за първи път се появи в книгата на Карл Майер през 1819 година.

Нобеловата награда за физиология и медицина от 1906 година е присъдена на хистолозите Camillo Golgi и Santiago Ramon Cajal. Те имат дуалистични интерпретации на нервната структура на мозъка, базирани на различни интерпретации на едни и същи образи.

Кои изследвания се отнасят към хистологично изследване?

Към хистологично изследване се отнасят некропсия и биопсия.

• Некропсията представлява хистологично или електронн-микроскопско изследване на късче от тъкани или органи на починал човек. Късчето тъкан (некропсия) се взема по време на аутопсия от тези органи и тъкани, които са предмет на изследване. Това са най-често патологично променени зони, в които е необходимо де се постави патологична диагноза. Некропсичното късче по правило е 1.5 на 1.5 сантиметра и се изрязва във форма на кубче. Понякога некропсията може да има по-големи размери, за което са необходими специални условия за хистологична обработка. Некропсичният материал се поставя във фиксатор, който да съхрани тъканта, както и да създаде оптимални условия за хистологичната обработка.
• Биопсията е медицинско изследване, обикновено провеждано от хирург, интервенционен рентгенолог или интервенционен кардиолог, включващ екстракция на проби от клетки или тъкани за изследване за определяне на наличието или степента на заболяване. Тъканта обикновено се изследва под микроскоп от патолог и може да се анализира химически. Когато се премахне цяла бучка или подозрителна област, процедурата се нарича биопсия. Когато се отстранява само проба от тъкан със запазване на хистологичната цялост на клетките на тъканта, процедурата се нарича инцизионна биопсия.

Кои са видовете биобсия,в зависимост от техниката на тяхното вземане?

Различават се няколко вида биопсии, в зависимост от техниката на тяхното вземане:

• Хирургическа биопсия – това е най-старата, но е загубила своята актуалност техника. Биопсичният материал се взема по време на хирургическа операция или амбулаторно, с помощта на скалпел. Целта на хирурга е с помощта на биопсията да изясни диагнозата на болния. Последвалото хистологично изследване позволява да установи наличието на патологичен процес.
• Пункционна биопсия – осъществява се със специално конструирана игла, която се вкарва в изследвания орган. Изваденият от иглата материал е сравнително оскъден, но по правило достатъчен за провеждане на хистологичното изследване. С помощта на пункционна биопсия става възможно хистологичното изследване на всички органи и тъкани.
• Тънкоиглена биопсия – представлява пункционна биопсия, но се осъществява с много тънка игла, под ехографски контрол.
• Аспирационна биопсия – биопсичният материал се взема чрез аспириране на тъкан от долепена до даден орган сонда.
• Щипкова биопсия – получава се с помощта на два метода:
• • фиброгастроскопски метод – осъществява се с фиброгастроскоп, който представлява оптическа система, комбинирана с щипка. Този апарат прониква през хранопровода и позволява не само макроскопски оглед на стомаха или дуоденума, но и да се вземе биопсия от желани зони.
  • ректороманоскопски метод – биопсията се взема с помощта на щипка по време на ректороманоскопското изследване на правото черво.
• бронхоскопия – осъществява се при изследване на белите дробове и позволява вземане на биопсичен материал.

За какво се използват химическите фиксатори?

Химическите фиксатори се използват за запазване на тъканта от разграждане и за поддържане на структурата на клетката. Най- често срещаният фиксатор за светлинна микроскопия е 10% неутрално буфериран формалин (4% формалдехид във фосфатно буфериран физиологичен разтвор). За електронна микроскопия най-често използваният фиксатор е глутаралдехид, обикновено като 2,5% разтвор във фосфатно буфериран физиологичен разтвор. Тези фиксатори запазват тъканите или клетките главно чрез необратимо кръстосано свързващи протеини.

Основното действие на тези алдехидни фиксатори е да се омрежват аминогрупи в протеини чрез образуване на метиленови мостове (-CH2-), в случая на формалдехид или чрез C5H10 напречни връзки в случая на глутаралдехид. Този процес, при запазване на структурната цялост на клетките и тъканите, може да увреди биологичната функционалност на белтъците, по-специално ензимите, и може да ги денатурира до известна степен. Това може да бъде вредно за определени хистологични техники. Допълнителни фиксатори често се използват за електронна микроскопия като осмиев тетраоксид или уранил ацетат.

Целта на тъканната обработка е да се отстрани водата от тъканите и да се замени със среда, която се втвърдява, за да се разрежат на тънки срезове. Биологичната тъкан трябва да бъде преобразувана в твърда матрица, за да може да се разрязва достатъчно тънки слоеве, обикновено дебелина 5 μm (микрометра, дебелина 1000 микрометра = 1 mm) за светлинна микроскопия и 80-100 nm (нанометър, 1 000 000 нанометра = 1 mm) за електронна микроскопия. За светлинна микроскопия най-често се използва парафин.
Тъй като е несмесваем с водата, основната съставка на биологичната тъкан, водата трябва първо да бъде отстранена в процеса на обезводняване. Пробите се прехвърлят през вани с прогресивно по-концентриран етанол, за да се отстрани водата. Това е последвано от хидрофобно почистващо средство (като ксилен) за отстраняване на алкохола и накрая разтопен парафинов восък, инфилтрационният агент, който заменя ксилола. Парафиновият восък не осигурява достатъчно твърда матрица за рязане на много тънки слоеве за електронен микроскоп. Вместо това се използват смоли.

Епоксидните смоли са най-често използваната среда за втвърдяване, но също така се използват акрилни смоли, особено когато се изисква имунохистохимия. По-дебели сечения (0.35 до 5μm) от залепена със смола тъкан също могат да бъдат нарязани за светлинна микроскопия. Отново не смесимостта на повечето епоксидни и акрилни смоли с вода налага използването на дехидратация, обикновено с етанол.

Какво представлява външното вграждане?

След като тъканите са дехидратирани, изчистени и инфилтрирани с материала за вграждане, те са готови за външно вграждане. По време на този процес тъканните проби се поставят в калъпи заедно с материал за втвърдяване (като агар, желатин или восък), който след това се втвърдява. Това се постига чрез охлаждане в случай на парафинов восък и нагряване (втвърдяване) при епоксидни смоли. Акрилните смоли се полимеризират чрез топлина, ултравиолетова светлина или химични катализатори. Закалените блокове, съдържащи тъканните проби, са готови да бъдат разрязани.

Тъй като тъканите, фиксирани с формалин, съдържащи парафин могат да бъдат съхранявани неопределено време при стайна температура и нуклеинови киселини могат да се възстановят от тях десетилетия след фиксирането, тъканите са важен ресурс за историческите изследвания в медицината.

Вграждането може да се осъществи и при използване на замразена, нефиксирана тъкан в среда на водна основа. Предварително замразените тъкани се поставят заедно с материала за втвърдяване на течността, обикновено воден гликол или смола, който след това се замразява, за да се образуват втвърдени блокове.

За светлинна микроскопия се използва стоманен нож, монтиран в микротом, за изрязване на тъканни секции с дебелина 4 микрометра, които са монтирани върху стъклен микроскопски плъзгач. За трансмисионна електронна микроскопия се използва диамантен нож, монтиран в ултра микротом, за изрязване на 50-нанометражни дебели тъканни участъци, които са монтирани върху медна решетка с диаметър 3 милиметра. След това монтираните секции се обработват с подходящо оцветяване.

Секциите могат да бъдат прерязани през тъканта в редица направления. За патологична оценка на тъканите е обичайният метод вертикалното сечение (нарязано перпендикулярно на повърхността на тъканта, за да се получи напречно сечение). Хоризонтално (познато също като напречно или надлъжно) сечение, отрязано по дължината на дългите оси на тъканта, често се използва при оценката на космените фоликули и космените частици.

Какви са техниките за оцветяване?

Биологичната тъкан има малък вътрешен контраст или в светлинен, или в електронен микроскоп. Оцветяването се използва, за да се получи както контраст на тъканта, така и да се подчертаят особеностите, които представляват интерес. Когато се разбира основната механична химия на оцветяването, се използва терминът хистохимия. Хематоксилин и еозин е най-често използваното светлинно микроскопично петно при хистологично изследване и хистопатологията. Хематоксилин, основно багрило, оцветява ядрото на клетката поради афинитета към нуклеинови киселини в клетъчното ядро. Еозин, киселинно багрило, оцветява цитоплазмата в розово. Уран ацетат и оловен цитрат обикновено се използват за придаване на контраст на тъканта в електронен микроскоп.

Има много други техники за оцветяване, които са били използвани за селективно оцветяване на клетки и клетъчни компоненти. Една от тези техники включва маркиране на периферни тумори или хирургически граници, при които определен цвят на багрилото се прилага към задната граница на пробата, друг към предния и така нататък, така че да може да се идентифицира местоположението на тумор или друга патология в един екземпляр. Други съединения, използвани за оцветяване на тъканни срезове, включват сафранин, маслено червено, конго червено, сребърни соли и многобройни естествени и изкуствени багрила, които обикновено произлизат от развитието на бои за текстилната промишленост.

Хистохимията се отнася до науката за използване на химични реакции между лабораторни химикали и компоненти в тъканите. Най- често провежданата хистохимична техника е реакцията на Perls Prussian blue, използвана за демонстриране на железни отлагания при заболявания като хемохроматоза.
Хистологичните проби често са били изследвани чрез радиоактивни техники. По-често авторадиографията се използва за визуализиране на местоположенията, към които е транспортирано радиоактивно вещество в тялото, като например клетки в S фаза (подложени на ДНК репликация), които включват третиран тимидин или места, към които се свързват радио маркирани сонди на нуклеинова киселина in situ хибридизация. За авторадиография на микроскопично ниво плъзгачът обикновено се потапя в емулсия на течен ядрен тракт, който изсъхва, за да образува фолиото за експозиция. Отделните сребърни зърна във филма се визуализират с микроскопия на тъмно поле.

Напоследък са използвани антитела за специфично визуализиране на протеини, въглехидрати и липиди. Този процес се нарича имунохистохимия, или когато петната е флуоресцентна молекула, имунофлуоресценция. Тази техника значително увеличава способността да се идентифицират категориите клетки под микроскоп.
Други усъвършенствани техники, като нерадиоактивна in situ хибридизация, могат да бъдат комбинирани с имунохимията за идентифициране на специфични ДНК или РНК молекули с флуоресцентни сонди или тагове, които могат да бъдат използвани за имунофлуоресценция и ензимно свързана флуоресцентна амплификация (особено усилване на алкална фосфатаза и тирамид). Флуоресцентната микроскопия и конфокалната микроскопия се използват за откриване на флуоресцентни сигнали с добри вътреклетъчни детайли. Цифровите фотоапарати се използват все повече за улавяне на хистологично и хистопатологично изображение.

Автор: д-р Теодора Тотева-Петкова