Хистохимично изследване

Какво е хистохимията?

Хистохимията-химията в контекста на биологичната тъкан – е безценен набор от техники, използвани за визуализиране на биологичните структури. Това поле се намира в интерфейса на органичната химия, биохимията и биологията. Интегрирането на тези дисциплини през миналия век позволява изобразяването на клетки и тъкани с помощта на микроскопия. Днес, като се използват уникалните химични среди в клетките, техниките на хетероложната експресия и ензимната активност, могат да се използват хистохимични методи за визуализиране на структури в живата материя.

Каква е цаелта на хистохимията?

Целта на хистохимията е да осигури цвят и контраст на микроскопичните изображения. Полето използва различни техники за изпълнение на специфичното етикетиране на биологичните структури. Хистохимиците провокират използването на клетъчни петна с малки молекули, маркирани молекули като антитела и ензимно-медиирано детектиране и усилване на сигнала. Исторически обаче, хистохимията е синоним на изобразяването на фиксирани (тоест мъртви) клетки и тъкани. Появата на техниките за генетична манипулация значително разширява хистохимичните методи към живите клетки.

За какво се използват хистохимичните методи?

Хистохимичните методи се използват широко при морфологичните изследвания и диагностика. Чрез тях на вътреклетъчно, клетъчно и тъканно ниво се проследяват химичните процеси и промените, настъпващи по време на жизнения цикъл в организма. Особено голямо е значението на хистохимично изследване при диагностика на туморите на стомашно-чревния тракт, кожата, белите дробове, бъбреците, матката и други.

Най-съвременните хистохимични методи за изследване, използвани с успех през последните години в онкологията, са имунохистохимичните. С помощта на тези методи се осъществява не само имунологичното типизиране на различните тумори, но се прави и диференциална диагноза на тумори от различни хистогенетични типове, изявяване на метастази в лимфни възли и костен мозък и други. По този начин се спомага за решаване на тъканната и органична принадлежност и евентуална прогноза за заболяването.

Имунохистохимичните изследвания се основават на концепцията, съгласно която неопластичните клетки експресират програма за диференциация, сходна с диференцировъчната програма на предполагаемия хистогенетиен източник на тумора. Имунохистохимичното изследване чрез епителни, мезенхимни, лимфоцитни и други маркери може да подпомогне изявяването и точната характеристика в тъканните срези на клетки от ниско диференцирани тумори или техни метастази.

С помощта на моноклонални антитела към белтъците на междинните епителни, мезенхимни или лимфоидни продукти, които се подчиняват на определени правила, отразяващи типа и състоянието на диференциация на съответните клетки, може с голяма вероятност да се докаже видовата принадлежност на туморните клетки, особено в случаите, когато не е възможно на светлинен микроскоп или със стандартните хистохимични методи.

 

По принцип всички хистохимични изследвания могат да се извършват върху различен хистологичен материал:

трупен
животински
следоперационен
отпечатъци
намазки
тъканни култури
Изискванията при вземане на материал за изследване са:

максимална бързо вземане
да бъде достатъчно по количество и с размери не по-малко от 0.5 кубични сантиметра
тъканта да не се малтретира и рязането да става с остър нож
необходимо е да има материал от различни участъци, с оглед сравняване на находките
За запазване прежизнената структура на тъкани и клетки и съдържанието на химични вещества в тях е необходимо материалът да бъди фиксиран. Фиксаторът преустановява протичането на химичните реакции в клетките и тъканите след отделянето им от организма, предотвратява автолизата и разпада под влияние на фактори от околната среда.

Изборът на фиксатор се определя от целта на изследването, вида на материала, химичните свойства на изучаваните вещества и времето, с което разполага патологът. Използват се същите фиксатори както при хистологично изследване.

Като метод за фиксация се използва и замразяване на срезите – свежи или фиксирани на формалинови пари тъкани. За направа на хистологични срези се използват замразяващ микротом или криостат. Основните групи вещества и техните продукти, които могат да бъдат доказани чрез методите на хистохимичния анализ, са въглехидрати, липиди, белтъци ферменти и други.

По-долу са дадени методите за оцветяване, използвани при хистохимично изследване:

Киселинна фосфатазна реакция – тази хистохимична техника се използва за разпознаване на лизозомите, дължащи се на съдържанието на киселинна фосфатаза. Секциите се инкубират в разтвор, съдържащ оловен фосфат. Фосфатът се освобождава чрез ензимна активност на киселата фосфатаза (лизозомен ензим) и се утаява като оловен фосфат и след това се превръща в оловен сулфид – черен депозит.
Алкална фосфатаза – хистохимичната техника, използвана за доказване на ензима, алкална фосфатаза, потъмнява клетките и тъканите, съдържащи ензима. Като цяло, степента на чернотата се корелира с наличното количество ензим. Точното локализиране се усложнява от факта, че ензимът може да промени своето вътрешноклетъчно положение по време на хистологичната процедура. Секциите се инкубират в разтвор, състоящ се от натриев глицерофосфат и калциев нитрат. Чрез действието на фосфатазата калциевият фосфат се утаява в тези региони, където е налице ензимът. За визуализация в секции калциевият фосфат се превръща в кобалтов фосфат и накрая в кобалтов сулфид, който е черен.
Азокармин – ядрата са тъмночервени, а цитоплазмата е бледо червена.
Azure II – Еозин: ядрото е синьо или лилаво. Базофилен материал син. Ацидофилен материал червен. Червените кръвни телца са оранжеви.
Берлинско синьо (пруско синьо) – неразтворимо частици желязо-цианидно съединение, което се използва за инжектиране на кръвни и лимфни съдове.
Кармин – специфично оцветяване за гликоген, чрез което гликогенните гранули се оцветяват в червено. PAS (периодична киселинна реакция на Шиф) също оцветява гликогенно червено и се използва по-често.
Сребърен метод на Bielschowsky – ретикуларните фибрили на съединителната тъкан са черни. Всички други структури, жълти или кафяви. Метод на импрегниране, който зависи от намаляването от формалин на лесно редуцируемата сребърна сол, сребърен амониев хидроксид.
Метод Bodian Silver – металичното сребро се утаява чрез действието на редуциращ агент (или екзогенен или ендогенен). Екзогенното средство води до натрупвания върху ретикуларни влакна и части от сборния комплекс (аргирофилия). Ендогенното средство води до утаяване на гранули от ентероендокринни клетки (реакцията на артаентафин).
Cajal’s Silver Stain (Cajal) – неврофибрили, аксони и дендрити черни. Други части кафяви. Общият принцип на Cajal методите (и има много модификации) е приложението на фотографски разработчици към тъкани, които са били третирани със сребърен нитрат.
Хроматографски хематоксилин и флоксин – използването на тези багрила за диференциално оцветяване на алфа и бета клетки на островите на Langerhans е описано от Gomori, 1941 година. Гранулите на бета клетките са оцветени в тъмно синьо, а тези на алфа са розови или червени.
Cresyl violet – основно багрило.
Foots Silver – това е модификация на сребърния метод на Bielschowsky. Тънките колагенни или ретикуларни влакна оцветяват черно, други тъкани остават бледи. Азокарминът често се използва като противоположно оцветяване за оцветяване на клетките и за колагенно червено тъкан.
Giemsa – еозинат от метиленово синьо, азот В еозинат, лазурен еозинат, метилен синьо-хлорид в метанол.
Golgi – на повърхността на нервните клетки и клетките на невроглиазата се полага чернен оттенък на намалено сребро, така че формата на клетъчното тяло и неговите процеси да заемат видно място в почти безцветен фон. Тук и там се избират само единични клетки. Методът се състои основно от потапяне на пресни парчета нервна тъкан първо в разтвор на калиев дихромат (и обикновено и на осмова киселина) и след това в сребърен нитрат.
Хематоксилин и еозин – хематоксилинът не е истинско основно багрило. Използва се с посредник, който разпознава компонентите на анионната тъкан. Хематоксилинът е почти специфично оцветяване на хроматина и затова се нарича „основно“ петно. То оцветява ядрената мрежа, хромозомите в синьо. Това е регресивно петно и се екстрахира с много разредена киселина или киселинен алкохол. Може да се използва след почти всеки фиксатор и е постоянно петно. Еозинът е червено общо цитоплазмено петно. Той се комбинира с хемоглобин, за да даде оранжев цвят. Това е киселинна боя и термините ацидофилна, оксифилна и еозинофилна често се използват взаимозаменяемо. Той може да се използва след фиксиране и се използва като противоположно оцветяване в много комбинации в допълнение към хематоксилин.

Автор: д-р Теодора Тотева-Петкова